HyPro靶RNA临近标记技术

  • 简介
  • 技术原理
  • 实验流程
  • 技术优势
  • 应用场景
  • 结果展示

  • 非编码RNA与生物大分子的相互作用，在各种生命过程中广泛存在，并起着至关重要的调控作用。要想研究这些非编码RNA，如LncRNA,miRNA,CircRNA,tsRNA以及eRNA的功能，传统的RNA研究方法RIP，RNA pull down等在前些年已经广泛应用，然而，这些方法是在细胞裂解后再进行富集检测，此时细胞结构被破坏，使得检测结果很难反应细胞内真实结合状态。并且它们不擅长发现体内瞬时和弱的相互作用，难以进行空间层次的RNA-蛋白互作研究。

    在空间层次的RNA-蛋白互作研究中，RNA和蛋白质的液-液相分离（Liquid-liquid phase separation， LLPS）是近几年来国际生命科学领域的一个新兴热点。异常的相分离与多种人类疾病如神经退行性疾病和癌症有因果关系。相分离的凝聚物参与各种生物学活动，包括形成高级染色质结构[1]，基因表达调控[2]，对错误折叠或不需要的蛋白质的分类以进行自噬降解[3]。生物大分子（例如蛋白质和核酸）可以通过液-液相分离（LLPS）凝聚成类似液体的无膜生物分子凝聚物，这种时空定义的方式能够将行使特定功能所需的各种蛋白和RNA聚集在细胞内的小范围区域中，在没有整体基因表达水平变化的情况下提高参与生物学过程的RNA及蛋白丰度，从而有效促进蛋白和RNA发挥相应功能。例如，增强子RNA(enhancer RNA)和Med1 、BRD4等蛋白互作，与这些蛋白的内部无序区域IDRs结合后通过相分离过程形成致密的凝聚物以促进超级增强子的组装形成[1]。此外，在应激情况下，G3BP会与多种蛋白和RNA结合，形成一个复杂的蛋白-RNA交互网络。这时液-液相分离开始发生—RNA与蛋白质高度浓缩呈液滴状，应激颗粒由此组装形成，进而对内部的RNA进行控制。一旦敲除 G3BP，面临不良环境刺激时细胞无法形成应激颗粒，对RNA控制的能力下降，从而使细胞的死亡率随之增加[3]。。

          HyPro靶RNA临近标记（Hybridization-proximity labeling）是一种空间相互作用组学研究技术，为研究RNA与RNA互作、RNA与蛋白互作和液-液相分离动态过程提供了有力的支持[4]。传统的方法难以研究空间层次上的相互作用，而HyPro靶RNA邻近标记技术依赖于具有标记功能的酶—过氧化氢酶APEX2，在活细胞水平对邻近生物分子进行生物素标记。然后基于质谱的蛋白质组学技术HyPro-MS和高通量测序技术HyPro-seq，可以对靶标邻近的生物大分子进行高通量的筛选。


    图1. HyPro靶RNA临近标记技术。

    参考文献：

    [1] Arnold PR, Wells AD, Li XC.Front Cell Dev Biol. 2020.PMID: 31993419

    [2] Jessica Sheu-Gruttadauriaet al. Cell. 2018. PMID: 29576456

    [3] Protter DSW, et al. Trends Cell Biol. 2016. PMID: 27289443

    [4] Yap, Karen et al. Mol Cell. 2022. PMID: 34741808


  • HyPro酶是由APEX2和DIG结合蛋白以一段较短的linker连接在一起，共同组成的活性融合蛋白。其中DIG结合蛋白用于结合带有DIG修饰的DNA探针，而DIG-DNA探针是根据靶标RNA设计的一条或者多条互补的DNA序列；而APEX2在一定空间范围内游离，类似鱼竿拉扯的钩饵，在H2O2的催化下，能将生物素活化，共价连接到临近的RNA和蛋白上，因此该技术能够特异性识别目的RNA并通过生物素标记临近区域的RNA和蛋白，这些生物素化的RNA和蛋白可以被链霉亲和素偶联的磁珠富集，之后可以通过测序和质谱进行分析鉴定。

     

    图2. HyPro靶RNA临近标记技术原理图。地高辛标记探针与靶RNA结合，HyPro酶一端结合地高辛标记探针，一端活化biotin标记目标RNA空间临近的蛋白质、RNA，而后利用链霉亲和素磁珠捕获biotin标记的蛋白和RNA进行质谱和测序检测


  • 1. 既适用于强相互作用，也适用于弱相互作用以及瞬时相互作用；

    2. 在细胞内原位进行标记，反映细胞内真实状态，可以同时标记RNA和蛋白,可用来研究RNA-蛋白复合体的功能；

    3. 快速反应，在1min中之内完成标记，特异性高；标记范围为20nm，用来研究靶向RNA的空间互作关系；

    4. 几乎适用于所有的细胞类型和组织，实验使用的是APEX2的融合蛋白，与过表达APEX2的技术相比，适用于难以转染的细胞类型（例如干细胞、神经细胞）、非模式生物样本和临床样本；

    5. 融合蛋白的使用能够降低标记背景，降低细胞毒性以及错误定位概率；

    6. 样本量少，细胞用量10^7个细胞；组织300mg

  • 1. 适用于强相互作用，弱相互作用以及瞬时相互作用；

    2. 靶向miRNA/LncRNA/CircRNA/tsRNA的空间互作蛋白和RNA；

    3. 靶向RNA的空间分布和亚细胞定位；

    4. 探究RNA-蛋白复合体的功能；

    5. 研究由RNA和蛋白组成的生物分子凝聚体/无膜细胞器的功能；

    6. 研究RNA-蛋白复合体在大分子装配和液-液相分离过程中的动态变化；

    7. 研究由多种enhancer RNA/SE-lncRNA和蛋白组成的超级增强子的结构和功能；

    8. 研究R-loop招募蛋白调控转录和基因组稳定性；

    9. 研究环状DNA聚集调控癌基因转录。

  • 1. HyPro-MS目的ncRNA特异性富集的蛋白列表


    2. HyPro-MS 目的ncRNA富集蛋白GO/pathway分析和PPI分析